Yakko, Wakko et Dot sont les frères et sœur Warner, créés au début de l'âge d'or de l'animation américaine. Ces héros de cartoons loufoques s'avèrent rapidement incontrôlables, et sèment la panique dans les studios Warner Bros. Enfermés dans le château d'eau du studio, ils s'en échappent occasionnellement pour vivre bon nombre d'aventures historiques, face à des adversaires impuissants devant leurs bêtises. Il est impossible de définir exactement à quelle espèce animale ils appartiennent, au cours d'un épisode l'un des gardiens du studio leur demande successivement s'ils sont des chiens, des chats ou des lapins, ils répondirent en chœur, "Nous sommes des frères Warner !" De nombreux autres protagonistes font partie de l'univers des Animaniacs, ce qui permet ainsi de créer un tremplin pour d'autres personnages : Minus et Cortex, les souris mégalomanes voulant conquérir le monde (qui connaîtront un fort succès auprès du public) ; Rififi l'écureuil revêche, ex-star de dessin animé dans la plus pure tradition toons, et son neveu Noisette ; les Affranchis, pigeons au caractère trempé ; Toubeau et Mindy, Rita et Spot, ainsi que le Dr Gratésnif et l'infirmière Nounou. On compte également quelques personnages apparus plus tardivement : Poulbot, dont chaque épisode se conclut par la constatation effarée : « Mais, c'est un poulet ! » On trouve également monsieur Squelette, héros d'un petit pilote intitulé Squelette aux mains d'os, parodie comique d'Edward aux mains d'argent, ainsi que Flavio et Marina, des hippopotames à la mode .